Центр коллективного пользования научным оборудованием

Руководитель — к.м.н. Московцев Алексей Александрович
тел. (499) 151-83-30

bioinf@mail.ru; ckpniiopp@mail.ru

ckp@niiopp.ru

 

  

Последние десятилетия отличают расширение методологии биомедицинских наук в сторону методов с большим количеством одновременно измеряемых параметров. Возникновение и успехи “omics” ных наук (геномика, протеомика и др.), обусловлены новыми технологическими решениями, основанными не только на достижениях фундаментальных наук, но и на автоматизации измерений и процессов, а также развитии информационных систем. Повышение производительности аналитических методов и стремительное увеличение объема данных о биологических объектах актуализируют проблему сложности их вычислительного моделирования, решение которой за дальнейшим приростом производительности информационных систем, развитием специализированного математического аппарата и прогрессом в подходах математического моделирования.

С учетом вышеописанных тенденций в развитии биомедицины, методическое обеспечение ЦКП формируется с приоритетным вниманием к высокопроизводительным многопараметрическим подходам, таким, как биологические микрочипы, секвенирование, а также системам анализа процессов в режиме реального времени. Увеличение веса математических методов в биомедицинских исследованиях определяет необходимость использования и развития новых биоинформатических и статистических технологий обработки данных.

ЦКП ФГБНУ «НИИОПП» ориентирован на проведение фундаментальных и прикладных исследований патофизиологических механизмов сердечно-сосудистых, эндокринных, онкологических и ряда других заболеваний с использованием подходов общей патологии, молекулярной и клеточной биологии, молекулярной генетики, биофизики. Основным приоритетом ЦКП является междисциплинарная интеграция. Наш ЦКП был одним из первых аккредитованных участников технопарка Сколково. Специализацией ЦКП являются механизмы РНК-опосредуемой регуляции клеточных функций . Анализ кодирующей и не кодирующей белок частей транскриптома осуществляется с применением полнотранскриптомных микрочипов Affymetrix, RT-qPCR и NGS-секвенирования. Обработка данных проводится с применением программных продуктов, включающих в себя методы многопараметрической статистики.

Оснащение ЦКП позволяет проводить культивирование клеток различного тканевого происхождения, оценку функций клеток рядом методов, включая конфокальную лазерную сканирующую микроскопию и проточную цитометрию. ЦКП располагает возможностями в области метаболомного анализа.

Рис.1 Примеры проектирования, обсчета методами вычислительной гидродинамики, иммунофлуоресцентного анализа и прижизненной флуоресцентной микроскопии

Кроме акцента на высокопроизводительные методы биоанализа, мы ставим своей целью опережающее внедрение междисциплинарных решений для расширения методического обеспечения фундаментальных исследований в области общей и молекулярной патофизиологии. ЦКП НИИ общей патологии и патофизиологии был первой организацией в РФ, внедрившей полный цикл проектирования, гидродинамического расчета, мелкосерийного производства методом мягкой литографии микрофлюидных чипов. Микрофлюидика позволяет исследовать действие механических сил, оказываемых потоком крови, на эндотелиальные клетки, примеры различных изображений на этапах экспериментов приведены на рис.1

Методы

Технопарк позволяет реализовывать широкую группу методов, относящихся к таким областям, как клеточная биология, функциональная геномика, метаболомика, микрофлюидика. В последние годы ФГБНУ «НИИОПП» как ведущая научная организация участвует в Программе обновления материальной базы Министерства высшего образования и науки РФ, в рамках которой было закуплено несколько комплексов уникального прецизионного научного оборудования.

Среди них  — сканирующий ион-проводящий микроскоп (СИПМ), который был совмещен с конфокальным лазерным сканирующим модулем и с микрофлюидной системой контроля потока жидкости и температуры в единую уникальную научную установку (УНУ:  СИПМ-ЛСКФМ-МФ), позволяющую проводить измерения объектов не только в статических условиях, но и в динамических — в микрофлюидных чипах. Следует отметить, что у такой системы нет аналогов.

Рис.2 Уникальная научная установка Совмещённый сканирующий ион-проводящий и конфокальный микроскоп с системой контроля потока жидкости и температуры для измерений в микрофлюидных чипах

 СИПМ является подвидом сканирующего зондового микроскопа, в котором в качестве зонда используется капилляр с нанометровым размером сопла, заполненный раствором электролита. Таким образом, он оптимизирован для проведения измерений в физиологических условиях на живых биологических объектах. СИПМ позволяет не только получать изображения топографии объектов с высоким разрешением, но и изучать их механические свойства, ток ионных каналов, осуществлять локальную доставку лекарств. Сканирующий ион-проводящий микроскоп установлен на инвертированном флуоресцентном микроскопе Nikon TE2000, на боковом порту которого установлена система Nikon C1 для лазерной сканирующей конфокальной флуоресцентной микроскопии (ЛСКФМ). Это позволяет совмещать уникальные данные СИПМ с классическими оптическими методами микроскопии. Источником возбуждения в лазерном сканирующем микроскопе являются лазеры 488 нм и 544 нм. Системы контроля потока и температуры позволяют проводить измерения на базе микрофлюидных чипов, что ещё более приближает условия к физиологическим. Наличие потока, воздействующего на клетки и активный массоперенос характерны для многих типов тканей организма.

Система установлена на антивибрационном столе с системой активного подавления вибраций.
Данная УНУ СИПМ-ЛСКФМ-МФ (см. рис. 2) позволяет получать изображения топографии/картирования механических свойств в открытом микрофлюидном чипе в режиме СИПМ, ЛСКФМ, а также при постоянном потоке с контролем температуры. УНУ применяется для исследований в области механобиологии

Совмещённый сканирующий ион-проводящий микроскоп был закуплен и запущен в эксплуатацию в конце 2023.
Основные направления научных исследований на СИПМ-ЛСКФМ-МФ включают в себя:
исследование влияния различных гидродинамических условий на эндотелиальные клетки;
исследование механических свойств эритроцитов при воздействии факторов космического полета;
исследование жесткости клеток при стрессиндуцируемом клеточном старении.

Конкретные научно-технические задачи включают в себя:
измерения модуля Юнга и топографии поверхности эндотелиальных клеток при действии потока жидкости, совмещенное с детектированием гликокаликса с помощью специальных флуоресцентных зондов, измерения модуля Юнга и топографии поверхности эритроцитов, фибробластов и других типов клеток, совмещенное с анализом белков цитоскелета

В ЦКП представлены также другие виды микроскопии, в том числе прижизненная цейтраферная съемка с использованием миниинкубатора,
микроскопия в проходящем свете с фазовым контрастированием и контрастированием Хоффмана, флуоресцентная микроскопия клеток и тканей
восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching), резонансный перенос энергии между молекулами флуорофоров (FRET, Forster Resonance Energy Transfer), поверхностно-усиленная флуоресценция (SEF, Surface Enhanced Fluorescence);

методы масс-спектрометрии, в том числе:

времяпролетная масс-спектрометрия биообразцов с целью определения биологически активных веществ (Waters Xevo G2 QTof MS System с системой Acquity UPLC);
капиллярный электрофорез с масс-спектрометрической детекцией с целью определения биологически активных веществ в биообразцах

иммуногистохимический, иммуноцитохимический, иммуноферментный анализ клеток, тканей и биопроб
флуориметрия, поляризация флуоресценции, спектрофотометрия, спектрофлуориметрия биопроб

секвенирование ДНК, микросателлитный анализ, LOH, анализ метилирования ДНК, определение SNP, фрагментный анализ, AFLP-анализ;

проточная цитометрия с анализом клеточного цикла;

количественная ПЦР в режиме реального времени,
анализ экспрессии генов на основе количественной ПЦР кДНК, полученной с мРНК в результате реакции обратной транскрипции
анализ кривых плавления амплифицированного продукта с высоким разрешением (HRM)
анализ уровней мРНК и экспрессии микроРНК в формате биочипов;
хемилюминесцентный анализ
гельдокументирование и денситометрия
мягкая литография для производства микрофлюидных чипов

спектрофотометрия и спектрофлуориметрия.
метод «вестерн-блоттинг»
оптическая, импедансная и люминесцентная агрегометрия.

автоматизированная пробоподготовка для молекулярно-биологических методов (ПЦР, выделенение нуклеиновых кислот).

моделирование микрогравитации для клеточных технологий

 

Оборудование

Высокопроизводительный секвенатор BGI G400

Исследовательский комплекс на базе конфокального лазерного сканирующего микроскопа NIKON C1 (Nikon Япония), в составе: конфокальный лазерный сканирующий модуль с двумя лазерами (488 и 543 нм) инвертированный микроскоп Eclipse TE2000U ; перфузионная термостатируемая проточная ячейка
12-канальная система высокоточного дозирования жидкостей Cetoni для микрофлюидных приложений
Комплект оборудования для производства микрофлюидных биочипов методом мягкой литографии
Генетический анализатор (секвенатор) Applied Biosystems 3130 (Applied Biosystems, США)
ПЦР-амплификатор GeneAmp PCR 9700 Applied Biosystems (Applied Biosystems, США)
Контактный споттер PerkinElmer SpotArray 24 (PerkinElmer , США)
Сканер микрочипов Axon GenePix 4000B (Molecular Devices, США)
Градиентный ПЦР-амплификатор PalmCycler (Corbett Research, Австралия)
ПЦР-амплификатор Real-time PCR RotorGene 3000 (Corbett Research, Австралия)
ПЦР-амплификатор Real-time PCR BioRad CFX96 (BioRad, США)
Проточный цитофлуориметр FACS Calibur (BD Biosciences, США)

Станция регистрации изображений Kodak 440 CF (Kodak, США)
Капиллярный электрофорез Agilent CE – электрораспылитель (ESI) – масс-спектрометр Agilent IonTrap CE ( Agilent, США)
Жидкостной хроматограф Perkin Elmer серии 200, сопряженный c масс-спектрометром Agilent IonTrap 200 (Agilent, США)
Времяпролетный масс-спектрометр Waters Xevo G2 QTof MS System с системой Acquity UPLC Xevo G2 QTof MS System (Waters, США)
Мультискан Chameleon (Hidex Oy, Финляндия)
Спектрофлуориметр HORIBA FluoroMax 4 (HORIBA, Япония)
Спектрофотометр Perkin Elmer Lambda (Perkin Elmer, США)
Спектрофотометр NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, США)
Станция автоматической пробоподготовки и дозирования Eppendorf Epimotion 5075TMX (Eppendorf, Германия)
Оборудование для гибридизации и сканирования чипов Affymetrix.

 

Программное обеспечение и методы обработки данных

ПО Nikon EZ-C1 для конфокальной микроскопии, обработки микрофотографий, колокализации флуоресцентных зондов и трехмерной реконструкции изображений.
ПО KODAK 1D для визуализации и анализа изображений, включая денситометрию.
ПО MikroWin для анализа данных фотометрии, флуоресценции, люминисценции в формате иммунологических планшет с возможностью визуализации многомерных данных, статистической обработки (включая кластерный анализ), анализа кинетики и т.п.
ПО Acuity 4.0 для биоинформационного анализа многомерных данных, включая анализ экспрессии генов.
Методы:
методы нормализации, в частности, локальная взвешенная регрессия;
замещение отсутствующих значений по методу ближайших соседей;
построение самоорганизующихся карт на основе различных метрик подобия;
построение иерархических кластеров и дендрограмм;
анализ главных компонент;
нахождение сходных профилей экспрессии генов по гену в серии экспериментов; построение хромосомных карт экспрессии;
аннотация по генной онтологии, группировка генов по онтологии;
построение 3d-графиков рассеяния с возможностью анимации.
ПО Axon GenePix Pro 7.1 для анализа изображений микрочипов.
ПО MATLAB 2009 (MathWorks) с пакетом биоинформационной обработки данных и биомоделирования.
ПО CellQuest Pro для анализа данных проточной цитометрии.
ПО ModFit LT для анализа клеточного цикла.
ПО SpotArray (Perkinelmer) для дизайна и производства биочипов.
Пакеты ПО для биоинформационного моделирования, выравнивания нуклеотидных последовательностей и т.д. (ПО с открытым исходным кодом, лицензии GPL).

Руководитель ЦКП НИИ ОПП

к.м.н. Московцев А.А